NAFLD相关肝癌患者肠道菌群或抑制外周免疫
IF:14.1
2.背景与意义据报道，肠道微生物群可调节肝细胞癌(HCC)的免疫应答。本文采用宏基因组学和代谢组学研究非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)相关肝硬化患者的肠道菌群特征，并在一个体外模型中评估其对外周免疫应答的影响。发现NAFLD相关肝细胞癌患者的肠道菌群组成和功能发生改变，菌群中产短链脂肪酸细菌种类增加，其肠道菌群提取物在体外可诱导免疫抑制表型，这或与HCC患者较差的临床结果和免疫治疗耐药性有关。肝细胞癌(HCC)是全球癌症相关死亡率的第四大原因，慢性肝脏炎症和肝硬化是HCC发病的关键。HCC的外周免疫反应会影响疾病的临床进程、对治疗的反应和总体存活率。越来越多的证据表明，肠道微生物群可以直接或间接调节T细胞免疫。3.实验设计4.结果与讨论1参与者样本收集与临床信息对比90名临床参与者的粪便与外周血样本：32例NAFLD-HCC，28例NAFLD-肝硬化和30例无NAFLD对照。
2外周血基线免疫细胞定量
NAFLD-HCC受试者中调节性T细胞较高(Tregs;CD3+CD4+CD25+Foxp3+)与NAFLD组肝硬化组和非NAFLD组比较(图1)。相反,NAFLD-HCC受试者较低比例的CD8+T细胞(CD3+CD8+)相比NAFLD-cirrhosis和non-NAFLDcontrol(图1)。总的来说，与NAFLD肝硬化相比，HCC患者具有较高比例的调节性T细胞以及较低比例的CD8+T细胞。
图1.
3宏基因组测序证实了肝癌肠道菌群的失调
宏基因组测序证实，与非NAFLD对照相比，NAFLD-HCC和NAFLD-肝硬化的粪便样本存在生态失调(图2a,b)。在门水平上，与非NAFLD对照相比，NAFLD-HCC的特征是变形菌门的丰度增加(P=0.)，但与NAFLD-肝硬化相比则无差异(图2c)。在科水平上，与NAFLD-肝硬化(P=0.)和非NAFLD对照组(P=0.)相比，在NAFLD-HCC中观察到肠杆菌科的增长。NAFLD-HCC的另一个特征是与非NAFLD对照相比，螺旋菌科(P=0.)和Erysipelotrichaceae(P=0.)的减少，但与NAFLD-肝硬化相比没有减少。对参与者的粪便样本进行宏基因组分析发现，与无NAFLD对照组相比，NAFLD肝硬化与NAFLD-HCC菌群存在失调。
图2.
4NAFLD-HCC微生物组的功能特征
测定了来自NAFLD-HCC、NAFLD-肝硬化和非NAFLD对照的样本粪便中负责短链脂肪酸合成的细菌基因的丰度。丙酮酸羧化酶(pycA)，负责生产的草酰乙酸丙酮酸是过表达NAFLD-HCC相比NAFLD-cirrhosis和non-NAFLDcontrol(P=0.)(图3b)。此外，NAFLD-HCC与NAFLD肝硬化和非NAFLD对照组相比，乙酸合成相关的基因磷酸乙酰转移酶和丁酸/乙酰磷酸合成酶，磷酸丁酰转移酶均过表达(P=0.,P=0.)(图3b)。然而，并不是所有在乙酸和丁酸合成中重要的基因都在NAFLD-HCC微生物群系中过表达。此外，与非NAFLD对照相比，丙酸合成途径中的两个基因富马酸还原酶(frd)和琥珀酸辅酶a合成酶(sucC)在NAFLD-HCC微生物组中过表达(P=0.和P=0.)。NAFLD-HCC组中富集了多个短链脂肪酸（SCFA）产生细菌，这些细菌被报道具有免疫调节能力。进一步的功能基因分析显示，介导膳食纤维合成SCFAs的功能基因丰度也在NAFLD-HCC组中显著增加，包括丙酮酸羧化酶（pycA）等。
图3.
5
NAFLD-HCC受试者的粪便和血清中SCFA及其中间体浓度升高
在粪便中，用LCMS/MS测定了65种细菌代谢过程中重要的代谢物。其中有3种是NAFLD-HCC特异性的，草酰乙酸，乙酰磷酸酯和异柠檬酸。草酰乙酸和乙酰磷酸酯是已知的SCFA中间体(图3a)，与NAFLD-肝硬化和非NAFLD对照组相比，NAFLD-HCC患者粪便中草酰乙酸和乙酰磷酸酯含量显著升高(图4a)，而与NAFLD-肝硬化和非NAFLD对照组相比，NAFLD-HCC粪便中的异柠檬酸水平更低。此外，使用1H-NMR对粪便和血清样品中的6种关键短链脂肪酸进行绝对定量。在血清中，发现与NAFLD-肝硬化和非NAFLD对照相比，NAFLD-HCC患者的丁酸(P=0.)和丙酸(P=0.)水平升高(图4c)。与非NAFLD对照组相比，NAFLD-HCC和NAFLD肝硬化患者血清丙二酸均升高。然而，NAFLD-HCC组和NAFLD肝硬化组之间无差异(图4c)。各组间血清乙酸、甲酸和戊酸水平无显著差异。
图4.
6
体外研究表明NAFLD-HCC微生物群可引起免疫抑制反应
研究者进一步用离体细胞模型研究微生物群对外周免疫反应的影响。结果发现来自NAFLD-HCC的微生物群细菌提取物在体外可诱导免疫抑制表型，包括调节性T细胞的扩增和CD8+T细胞的衰减，减少抗原递呈细胞，同时诱导的细胞因子也支持免疫抑制表型。
为了进一步表征外周免疫反应的变化，在体外模型中测量了抗原呈递细胞群，包括单核细胞(CD3CD14+)、髓样树突状细胞(CD3HLADR+CD11c+)和B细胞(CD19+CD20+)，与NAFLD-肝硬化和非NAFLD对照的BE相比，来自NAFLD-HCC的BE削弱了单核细胞的扩张(P=0.)(图5c)。同样，与NAFLD-肝硬化和非NAFLD对照相比，来自NAFLD-HCC的BE削弱了B细胞的扩张(P=0.)(图5d)。
图5.
7
NAFLD-HCC微生物群诱导了免疫抑制的细胞因子
研究表明IL-2和IL-12在CD8+T细胞扩张和激活中很重要。本研究发现来自NAFLD-HCC抑制促炎细胞因子的生产相比NAFLD-cirrhosis和non-NAFLDcontrol显著降低(图6)。此外，NAFLD-HCC和NAFLD-cirrhosisnon-NAFLD相比，抑制IL-4的显著降低(图6)。相反，IL-6和IL-10在NAFLD-HCC显著升高。
图6.
通过对微生物菌群丰度、粪便代谢物含量以及离体模型中的T细胞反应的相关性分析，发现NAFLD-HCC肠道菌群的含量与IL-10+Tregs，CD8+T细胞等免疫表型具有显著的正相关或负相关：短链脂肪酸及其中间体，例如丁酸与Tregs及IL-10+Tregs呈正相关，与CD8+T细胞呈负相关。利用这些结果，研究者构建了NAFLD-HCC微生物群、短链脂肪酸以及免疫抑制表型之间的调控模型。
5.结论本研究通过宏基因组与代谢组学技术，深入解析了肠道菌群及其代谢物经肠-肝轴对肝病/HCC患者的外周免疫进行特异性调节的机制。确定了NAFLD-HCC疾病相关的关键肠道菌种，基因功能及代谢组学证据表明这些菌群增加短链脂肪酸合成，导致免疫抑制反应。本研究进一步突显了肠道菌群及其代谢物研究在HCC预后标志物开发和新治疗策略制定中的潜在价值。本文研究也很好的将肠道微生物和肝癌联系到一起。本研究通过宏基因组与代谢组学技术，深入解析了肠道菌群及其代谢物经肠-肝轴对肝病/HCC患者的外周免疫进行特异性调节的机制。确定了NAFLD-HCC疾病相关的关键肠道菌种，基因功能及代谢组学证据表明这些菌群增加短链脂肪酸合成，导致免疫抑制反应。本研究进一步突显了肠道菌群及其代谢物研究在HCC预后标志物开发和新治疗策略制定中的潜在价值。本文研究也很好的将肠道微生物和肝癌联系到一起。
来源：水产设施养殖与装备工程研究中心
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