最近，哈佛大学医学院免疫生物系的Kim等研究者在小鼠实验中发现，“母体肠道细菌通过改变CD4+T细胞的染色质结构导致后代伴有神经发育障碍的肠道炎症”。论文发表于的Immunity杂志。其中病*感染诱发怀孕母鼠的肠道微生态变化，而母体中的胚胎暴露于子宫中的高度炎症环境，导致后代免疫致敏状态。肠道炎症出现家族遗传的原因之一，可能是母亲怀孕期间病*感染改变了肠道菌群。
自闭症谱系障碍儿童经常表现出免疫反应失调。最近在小鼠使用临床前母体免疫激活后的神经发育病理模型，Kim等人揭示了怀孕小鼠肠道菌群的变化如何影响后代体内幼稚CD4+T细胞的染色质可及性，进而导致免疫引发的表型。
图示本研究的设计及发现的亮点：
1，产前暴露于母体免疫激活的小鼠表现出免疫致敏表型；
2，母体免疫激活诱导怀孕小鼠肠道菌群的变化；
3，改变的肠道菌群影响T细胞的染色质可及性并引发免疫致敏；
4，母体IL-17A通过肠道菌群的变化塑造免疫致敏的表型。
患有自闭症谱系障碍的儿童通常表现出免疫反应失调和相关的胃肠道症状。然而导致这两种表型发展的潜在机制尚未阐明。作者的研究表明，由于产前暴露于母体炎症的小鼠，其后代小鼠表现出自闭症样表型，并且在以后的生活受到困扰后，更容易发生肠道炎症。与其在神经发育表型中的产前作用相反，白介素-17A(IL-17A)引发的免疫致敏表型通过母体肠道菌群的变化，导致出生后幼稚CD4+T细胞的染色质景观发生改变。将具有高IL-17A反应的怀孕小鼠的粪便样本移植到无菌母鼠后代中，产生了免疫致敏的表型。研究表明，儿童暴露于子宫内高度炎症后，除了神经发育障碍外，可能会增加患炎症性疾病的风险。研究提供了这些关联的内在机制。
多项研究表明，怀孕期间的病*感染与后代自闭症谱系障碍(ASD)的频率增加有关，而且患有ASD的人也出现广泛的非神经系统合并症，包括免疫和胃肠道(GI)功能障碍。但是其确切机制尚不明了，为此作者应用小鼠模型，进行了详细的研究。
研究过程
研究概述
诱导母体免疫激活(MIA)是通过怀孕期间(胚胎第12.5天)小鼠腹腔内注射病*模拟物poly[I:C]。MIA母亲的后代表现出行为表型，例如社交能力缺陷和重复行为。作者发现，MIA后代也具有表观遗传致敏的CD4+T细胞，这些细胞暴露于淋巴细胞减少症或细菌感染时，很容易分化成炎性T效应细胞，并表现出对结肠炎样和其他炎症表型的高度易感性。与产前决定的行为表型不同，交叉寄养实验表明MIA后代的免疫表型是在出生后决定的。作者进一步观察到，MIA后代的免疫致敏表型是由母体肠道菌群的变化，并取决于母体IL-17A，后者也是导致MIA后代的行为和神经表型的细胞因子。作者还证明MIA后代中免疫致敏表型的诱导与神经发育表型可能是分离的。当怀孕的MIA母鼠缺乏复杂的微生物生态时，就能选择性阻止后代的免疫致敏表型的发生，而只有当无菌(GF)母鼠被来自暴露于MIA的、常规饲养的怀孕母鼠肠道菌群定植时就诱导出那些表型。这些数据共同提供了一个可能的机制，即怀孕期间暴露于增强的炎症会导致部分ASD个体出现持久的神经发育障碍和免疫致敏表型。
MIA后代对细菌引起的肠道炎症易感性增加
图1、MIA后代对细菌引起的肠道炎症的易感性增加
怀孕母鼠注射PBS或PolyI:C所生的7-8周龄后代(PBS和MIA后代)用甲硝唑预处理四天，然后用2xCFU的C.rodentium菌感染，10天后进行分析；发现MIA组的结肠长度明显缩短(C)；结肠隐窝增生明显，相关的组织学评分也明显增高(D)；MIA后代的血浆和结肠固有层T细胞中炎症细胞因子IL6、INF-g、TNF和IL17A浓度明显升高(E)。流式细胞术分析结肠固有层T细胞显示，MIA后代的IL-17A阳性、IFN-g阳性和IFN-g双阳性CD4+T细胞(F)和RORg和IL-17A双阳性CD4+T细胞(G、I)明显升高，而FoxP3+调节性T细胞明显降低(H、I)。
进一步研究证明，MIA后代的免疫易感性增加是由出生后决定的，如下图。
图2、MIA后代的免疫易感性增加是在出生后确定的
PBS(PBSo)和MIA(MIAo)后代在出生时交叉饲养(出生后第0天[P0])。7-8周大的后代被用于行为测试，然后进行C.rodentium感染实验。MIA诱发的行为异常，例如社交偏好降低和重复行为增加(埋珠实验)，不受交叉饲养所影响。相反，C.rodentium感染引起的炎症表型是由养母的处置条件决定的。而且，结肠的IL-17A和IFN-g阳性Th17细胞的百分比显着升高，而MIA母鼠饲养的后代的FoxP3+Tregs减少(G)。因此，MIA后代的免疫引发的表型可能是在出生后获得的，而他们的行为异常形成却是产前确定的。
肠道菌群是MIA后代免疫致敏的充要条件
作者的进一步应用粪便移植的实验，显示母体肠道微生物群足以在后代中产生持久的免疫致敏表型。
图三、MIA相关微生物群的转移在后代中诱导致敏的免疫表型
在PBS或MIA处置的E14.5怀孕母鼠中收集粪便样本(分别为PBS-ST[粪便转移]和MIAST)，并定殖于雌性B6GF小鼠，再于一周后与雄性B6GF交配。它们的后代(分别为PBS-ST后代和MIA-ST后代)进行行为分析，然后于7-8周龄时进行C.rodentium感染实验。PBS-ST和MIA-ST的后代都不显示与MIA相关的行为异常，例如社交能力降低和重复行为增强。但是与PBS-ST相比，在C.rodentium感染后MIA-ST后代表现出更高的炎症表型，例如结肠长度缩短(图3E)和结肠中产生IL-17A的CD4+T细胞比例增加，而FoxP3+Tregs的百分比无显著差异。为了进一步研究母体菌群在建立后代免疫状态中所起的关键作用，作者接下来将PBS或Poly(I:C)注射到用单一分段丝状细菌定植的B6母鼠(分别为SFB-mono-PBS和SFB-mono-MIA小鼠)。与既往发现一致，成年SFB-mono-MIA母鼠所生的后代表现出社交能力缺陷、总移动距离和增强的埋珠表型(H，I，J)。然而，与传统饲养的母鼠所生的不同(图1C和1F-1I)，SFB-mono-PBS和SFB-mono-MIA后代在结肠长度或产生IL-17A和IFN-g的T细胞和FoxP3+Tregs的百分比方面没有差异(图3K和3L)。
这些数据都支持这样一种观点：在暴露于炎症的怀孕鼠中，改变的肠道菌群通过支持特殊的T细胞反应，是导致MIA后代中持久的免疫致敏表型的充分和必要的条件。
MIA-CD4+T细胞的免疫致敏特性
为了揭示MIA-CD4+T细胞的免疫致敏特性，作者进一步将相对少量的T细胞转移到受体小鼠(图4A)。这一实验证明了MIA-CD4+T细胞优先分化并激活成炎性效应T细胞，如图四。
图四、MIA后代的CD4+T细胞在体内表现出增强的炎症表型。
在这个实验条件下，RAG1缺陷小鼠(无成熟T和B淋巴细胞的免疫缺陷鼠)接受幼稚MIA-CD4+T细胞后体重减轻，而接受PBS-CD4+的对照组组在T细胞转移后五周内稳定而适度地增加体重(图4B)。MIA-CD4+T细胞转移的小鼠六周后结肠较短(图4C)并显示淋巴细胞性结肠炎特征(图4D)。为了评估MIA后代的致敏免疫状态与转录组变化的关系，进行了批量RNA测序(RNA-seq)(图4E)。
RNA-seq和基因本体论(GO)分析显示，在MIA-CD4+T细胞中参与T细胞活化和T细胞受体信号的基因表达增加。此外，该基因集富集分析(GSEA)同样表明MIA-CD4+T细胞在转录上更倾向于支持MAPK活性、IL6-JAK-STAT3信号传导和Th17细胞分化(图4H和4I)。这些数据综合起来表明MIA后代的CD4+T细胞在淋巴细胞减少症小鼠中被致敏、并表达参与T细胞活化和T细胞受体信号通路的基因。
图五、MIACD4+T细胞优先编程成为炎症效应T细胞。
为了进一步弄清MIA后代的CD4+T细胞的转录启动状态是否同样反映在其染色质的结构，作者应用高通量测序(ATAC-seq)进行了转座酶可及性染色质分析(图5A)。来自PBS和MIA后代的幼稚CD4+T细胞显示独特的染色质可及性；PBS-CD4+T细胞中有个独特的ATAC峰，而MIA-CD4+T细胞中明显存在有1,个峰(图5B和5C)。在MIA-CD4+T细胞中发现独特的开放峰存在功能簇富集，并且与适应性免疫反应的调节，表观遗传调控和激酶活性调控都有关联(图5D)。开放峰是涉及T效应细胞分化和激活的基因，如Il6ra(IL-6受体亚基a)和Zbtb7a。ATAC-seq还确定了在染色质重塑中的相关基因，如Brd4、Smarcd2和Map4k2。Map4k2是一种MAP4激酶家族的成员，与T细胞活性调节有关(图5E)。因此，在MIA-CD4+T细胞中这些基因的mRNA表达适度升高的(图5F)。作者观察到改变的染色质可及性也存在于MIA粪便转移母体(MIA-ST后代)所生后代的幼稚CD4+T细胞中(图3A)。ATAC-seq结果显示在PBS-ST和MIA-ST的CD4+T细胞中分别有84个和个峰(图S6A和S6B)。与在MIA后代的幼稚CD4+T细胞中观察到的ATAC-seq谱一致(图5D)，在MIA-ST的CD4+T细胞中存在差异的ATAC-seq峰中富含那些参与激酶活性调节和T细胞活化基因。
这些数据综合表明，暴露于母体肠道菌群中MIA相关的变化会导致后代幼稚CD4+T细胞的染色质形态发生变化，从而出现致敏免疫反应。
IL-17A的依赖性变化
母体诱导的IL-17A对后代的免疫易感性至关重要。已经发现MIA导致孕妇体内血浆中增加IL-17A浓度，从而导致在后代中观察到的行为和神经学异常现象。因此作者检查了母体IL-17A是否促进MIA后代的免疫致敏表型。在胚胎期12.5天的怀孕母鼠用PBS或Poly(I:C)处理前5小时，给它们注射对照的同种型IgG或抗IL-17A阻断抗体(图6A)。
图六，母体肠道菌群的IL-17A依赖性变化促进MIA后代的炎症表型
这些母鼠所生的后代在7-8周龄后感染C.rodentium，并在感染后10天分析结果。在IL-17A阻断抗体(MIA抗IL-17A)预处理的母鼠注射Poly(I:C)的MIA后代显示出与PBS后代(PBS同种型)相当的结肠长度，与同种型IgG对照组有明显差别(图6B)。用抗IL-17A抗体治疗的母鼠的MIA后代中Th17细胞的比例、产生IFN-g的致病性Th17细胞以及Tregs与PBS对照组相当(图6C)。结果表明母体IL-17A在MIA后代C.rodentium感染后所观察到的免疫表型及其介导的肠道损害中起着至关重要的作用。母体菌群引起的MIA后代对C.rodentium所致的结肠炎易感性增加是否依赖于母体IL-17A呢？在胚胎14.5天的PBS同种型、MIA同种型或MIA抗IL-17A抗体处理的母鼠的粪便样本进行收集，然后转移到GFB6雌性小鼠。这些雌鼠与GFB6雄性小鼠杂交以产生从出生开始就暴露于PBS同种型、MIA同种型或MIA抗IL17A相关母体微生物群的后代。与MIA同种型ST后代不同，C.rodentium感染后，MIA抗IL-17A-ST后代既没有表现出结肠长度缩短，也没有表现出增强的IL-17A产生。这些结果表明MIA诱导的母体IL-17A的表达增加，通过改变怀孕母鼠的肠道菌群集落，导致MIA后代中观察到的致敏免疫表型。
研究的意义
总体而言，这个研究提供了环境刺激，例如产前暴露于母体炎症，可能会导致后代的免疫系统失调，出生后更容易受到炎症困扰。具体来说，它为神经发育障碍经常伴随炎症功能障碍的发生提供了重要的理论依据。例如，这些结果提示，ASD患者表现出较强的炎症表型，可能源自母体子宫内高度炎症暴露。理解母体肠道与后代的神经发育和免疫系统发育之间，错综复杂的相互作用，将帮助我们更好地应对孕期病*感染(包括目前新冠病*疫情)的长期影响。因此，尽管本研究是模拟病*感染，实验研究可能不代表临床的真实情况，我们仍然要警惕怀孕期间病*感染可能会影响后代健康。